Decalcificazione

Quando viene praticata la decalcificazione?

• In caso di malattia metabolica dell’osso  quando è necessario distinguere tra osso mineralizzato ed osso osteoide
• Per misurazioni morfometriche
• Esami del midollo osseo
• Diagnosi di tumori
• Diagnosi di infezioni

Come si pratica?

Poiché l’osso mineralizzato è molto duro, le tecniche per ottenere delle sezioni sono molto limitate.

• Dopo la fissazione può essere tagliato in strisce sottili e poi macinato, tramite superfici abrasive, per produrre della “terra”.
• Si possono ottenere campioni anche attraverso infiltrazioni di acrilici o resine epossidiche, che, una volta polimerizzate, hanno una durezza uguale a quella dell’osso mineralizzato.
• Si possono ottenere campioni usando il microtomo pesante, il carburo di tungsteno o il coltello di diamante.
• E’ possibile ottenere delle sezioni anche tramite congelamento dell’osso.
• La tecnica più comune per decalcificare un osso avviene tramite la fissazione, che permette di ottenere sezioni di paraffina.

Su quali ossa si pratica?

Pezzi di ossa sostituiti con protesi (es. testa del femore), cresta iliaca e campioni provenienti da amputazioni. Per poter ottenere campioni analizzabili è però necessaria una decalcificazione superficiale. 

Quanti tipi di osso maturo esistono?

• Osso corticale o compatto, che si trova nelle ossa lunghe, in quelle piatte del cranio, ed ha una struttua molto densa grazie a delle strutture cilindriche dette osteoni.
• Osso spugnoso o trabecolare che compone pareti sottili che collegano placche ossee che si trovano nel midollo osseo.

Tutte e due queste tipologie ossee si sviluppano in strati, o lamelle unite dal collagene.

Come avviene la fissazione di un osso?

Per proteggere gli elementi cellulari e fibrosi delle ossa dai prodotti usati nel processo di decalcificazione è importante analizzarli per bene prima di procedere. E’ prassi dei laboratori di estendere i tempi di fissazione per le ossa prima di procedere con la decalcificazione. Le ossa devono essere ben pulite e segate con arnesi adatti. 

Quali sono i principali agenti usati nelle decalcificazione?

• Basati su acidi minerali forti. Quelli che agiscono in modo più rapido sono l’acido cloridrico o nitrico in concentrazioni fino al 10%. Se usato per tempo eccessivo può però decolorare il nucleo e macerare i tessuti. Per questo è bene fare un test end-point per capire quali sono i tempi giusti di utilizzo.
• Basati su acidi organici deboli. L’acido formico è il più diffuso. Può essere usato come una soluzione acquosa diluita al 10% da utilizzare da sola o combinata alla formalina. I suoi tempi di azione sono più lenti rispetto agli acidi minerali forti.
• Composti di agenti chelanti. Agiscono catturando gli ioni di calcio dalla superficie del cristallo, riducendo la sua  dimensione. Agisce in modo molto lento (anche settimane) e per questo non è adatto per campioni urgenti. 

Quali sono i fattori che influenzano il tasso di decalcificazione?

• Concentrazione. Va relazionato con il tasso di calcio che verrà rimosso. Va ricordato che la concentrazione di un agente attivo sarà esaurita una volta combinata col calcio e per questo se ne consiglia un gran volume, ed eventualmente rinnovarlo durante il processo di decalcificazione.
• Temperatura. L’aumento della temperatra accellererà il tasso di decalcificazione, ma anche i danni ai tessuti, motivo per cui va prestata particolare attenzione.
• Agitazione. Può aumentare il tasso.
• Accesso fluido. Avrà un migliore accesso a tutte le parti del campione.

Come si determina il punto finale di decalcificazione?

Per ottenere un ottimo risultato è bene capire quando è il momento in cui tutto il calcio è stato rimosso. La troppo decalcificazione rovina il colore degli elementi basofili come nuclei delle cellule, e porta alla macerazione dei tessuti morbidi. Inoltre si rende impossibile procedere per ottenere delle sezioni. Il metodo migliore per capire il momento adatto è l’uso dei raggi X, che permette di vedere la presenza di residui di calcio. Un test chimico può essere usato in caso di uso di decalcificanti acidi. Ammonio ossalato viene aggiunto ad un campione del campione decalcificato. Se ci sarà ancora presenza di calcio si formerà un ossalato di calcio. Delle prove fisiche, come il teglio, permetteranno di vedere se nel campione sono presenti aree calcificate. Non è un metodo troppo affidabile. 

Quali processi vengono dopo la decalcificazione e prima della trasformazione?

In genere consistono in un lavaggio in acqua di rubinetto o all’applicazione di sostanze alcaline. 

Come si procede quando l’osso e i tessuti sono decalcificati?

Dipende dalla natura e dalle dimensioni del campione che vogliamo ottenere. 

Cos’è la decalcificazione superficiale?

Si usa quando ci troviamo a far fronte ad un inattesa presenza di calcio in blocchi di paraffina. Quando si taglia il microtomo ci possiamo trovare a far fronte a questa scoperta inattesa. Dopo che il tessuto è stato esposto il blocco può essere rimosso dal microtomo e rivolto verso il basso in un decalcificatore acido per 15-60 minuti. Infine il blocco può essere risciacquato con acqua per togliere l’acido residuo