Approfondimento di attualità a cura del Comitato Scientifico AIDM.
SEARCH, TEST, TREAT AND PREVENT dicono gli Inglesi (ovvero, "Ricerca, fai i test per essere sicuro della diagnosi, cura e previeni"), ed è l’ABC della gestione e della prevenzione delle malattie epidemiche o, come nel caso della Covid 19, pandemiche. E, per diagnosticare questa malattia, il test più attendibile al momento è l’esecuzione e l’analisi del tampone rinofaringeo e faringeo.
Da come se ne parla sui giornali e in TV, sembra a volte che i tamponi siano “l’anello di congiunzione” efficace tra il Coronavirus e la sua distruzione. In parte lo sono. Vale la pena riflettere un momento e capire cosa sono, a cosa servono, a chi eseguirli e perché.
Cosa sono i tamponi e come si usano?
Il tampone è un sottile bastoncino simile a un lungo cotton fioc con estremità in ovatta (o in materiale sintetico, capace di trattenere molto più materiale organico).
Il prelievo consiste nel prelevare cellule superficiali della mucosa della rinofaringe (è la sede migliore) o della parete posteriore della faringe (se l’accesso nasale non è possibile), sfregando il bastoncino sulla mucosa stessa. Si cerca di prediligere la mucosa rinofaringea perché vi è una alta espressione di recettori ACE2 cui si lega SARS-COV-2.
Il tampone viene eseguito in pochi secondi, non è doloroso, può dare a volte un lieve fastidio. Deve essere eseguito da personale addestrato, che prelevi nella sede corretta e sia munito di tutti i mezzi di protezione individuale, per evitare il potenziale contagio. Il campione non deve essere contaminato, va conservato e trasportato in modo idoneo (refrigerato); la provetta dove si inserisce il bastoncino deve essere chiusa, disinfettata all’esterno e riportare in etichetta i dati esatti della persona cui è stato fatto il prelievo. Il trasporto avviene con triplo imballaggio (imballo esterno, intermedio e interno a tenuta stagna), per impedire la fuoriuscita del contenuto anche in caso di incidente durante il trasporto.
L'analisi e i tempi di risposta? I campioni devono essere inviati immediatamente al laboratorio o, in alternativa, possono essere conservati in frigo (+4°C) per un tempo minore di 48 ore. Se il campione non può essere processato entro 48 ore, va conservato a -80°C. Dal materiale biologico viene effettuata l’estrazione e la purificazione dell’RNA, per la successiva ricerca dell’RNA del virus SARS-CoV-2, utilizzando il metodo Real Time PCR (Polymerase Chain Reaction), come indicato dall’OMS.
La durata del test molecolare è di circa 1 ora e 30 minuti, a cui andranno aggiunti i tempi di estrazione dell’RNA, per un totale di circa 4 ore; ma per i tempi di risposta vanno considerati anche le fasi di accettazione e preparazione del campione, di validazione del test e di refertazione, che sono influenzate sensibilmente dalla numerosità dei campioni e dal numero del personale addetto.
La Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha recentemente approvato un test italiano (Diasorin, sempre basato su PCR), che dà risposta in 1 ora, migliorando la potenzialità diagnostica.
Altri test sono ancora in fase di studio.
L’utilizzo della saliva al posto dei tamponi rinofaringei potrebbe costituire un’alternativa interessante, perché la raccolta della saliva è più facile e, da uno studio recente, sembra offrire una migliore sensibilità, rivelando positività che non vengono identificate col tampone.
Se questo test confermasse avere una buona sensibilità (ovvero la capacità di identificare correttamente i soggetti malati) e una altrettanto buona specificità (ovvero la capacità di identificare correttamente i soggetti sani), potrebbe tra qualche mese permettere un più numeroso ed economico campionamento.
A cosa serve il tampone?
Il tampone serve per diagnosticare la presenza/assenza del virus nell'organismo, nel momento in cui viene eseguito l’esame (stato attuale di contagiosità) oppure per confermare l’avvenuta guarigione. Non ci dice nulla sul passato (siamo negativi perché non abbiamo mai incontrato il virus, o perché siamo già guariti?) e, ovviamente, non ci può dare alcuna indicazione sul futuro.
Il problema dei "falsi negativi"
Si sono verificati casi di pazienti dichiarati guariti e dimessi dopo due tamponi negativi che sono stati nuovamente ricoverati per il ripresentarsi dei sintomi e ri-positivizzazione del tampone.
L’attuale posizione scientifica da parte dell’Istituto Superiore di Sanità non depone per una reinfezione, ma per una “falsa” negatività dei due tamponi, legata ad alcuni probabili fattori:
- la bassa carica virale al momento del prelievo, che non ha raggiunto livelli sufficienti a positivizzare l’analisi (infezioni iniziali o pazienti asintomatici);
- le infezioni avanzate, in cui permangono positivi solo i lavaggi bronco-alveolari;
- la scorretta esecuzione dell’esame, con prelievo solo del muco anteriore del naso.
A questo proposito, si segnala che la metodica illustrata sul sito del Ministero non corrisponde a un corretto prelievo dalla rinofaringe (per farlo correttamente, il tampone deve scorrere per 7-8 cm lungo il pavimento nasale fino alla parte posteriore, ove nei bambini albergano le adenoidi).
A chi fare il tampone e con quali criteri?
I tamponi si eseguono o per diagnosticare lo stato di malattia, o per verificare l’avvenuta guarigione.
I criteri per l’esecuzione dei tamponi a scopo diagnostico sono stati definiti a livello Nazionale dalla circolare del Ministero della Salute del 9/03/2020:
- Sintomatologia indicativa di infezione respiratoria acuta, con insorgenza improvvisa di almeno un sintomo tra Tosse, Difficoltà respiratorie, Febbre (> 37,5°C).
- Contatto con un caso confermato di COVID-19 nelle due settimane precedenti.
- Provenienza da aree con alto tasso di trasmissione locale.
- Assenza di un’altra causa che possa spiegare il quadro clinico.
Per verificare la guarigione, invece, vengono effettuati due tamponi (a distanza di almeno 24 ore l’uno dall’altro), quando la persona è clinicamente guarita, dopo il periodo di isolamento obbligatorio di 14 giorni.
Per confermare la guarigione, i risultati devono essere entrambi negativi. Qualora il tampone effettuato al termine della quarantena risultasse ancora positivo, il test dovrà essere ripetuto a distanza di un’ulteriore settimana e il paziente avrà una proroga del periodo di isolamento. Si può richiedere il tampone personalmente, attraverso i numeri di telefono Regionali dedicati, oppure tramite il medico curante, che segnala le persone al database regionale.
Di fronte allo scatenarsi di una malattia altamente contagiosa e sconosciuta come Covid-19 e in virtù della sua asimmetrica diffusione, l’autonomia delle Regioni ha comportato scelte molto diverse. Tra le Regioni più colpite, Piemonte e Lombardia hanno scelto di adeguarsi fedelmente alla circolare del 9/3/2020: tale burocratizzazione ha comportato, a volte, l’esigenza di dichiarare un “falso” recente incontro con persone provenienti da zone “rosse” per ottenere l’esecuzione del tampone e il ricovero, a fronte di una sintomatologia che assumeva connotati preoccupanti.
Il Veneto, invece, ha da subito attuato una politica massiccia di esecuzione a tappeto dei tamponi, in base a segnalazioni puntuali dei medici, approvvigionandosi in anticipo dei materiali necessari (che sono presto diventati difficili da reperire) e utilizzando anche le numerose donazioni.
Già al 15 marzo (solo quattro giorni dopo la “chiusura dell’Italia”, dichiarata integralmente zona rossa l’11 marzo), il Veneto (quasi 5 milioni di abitanti) aveva eseguito oltre 32 mila tamponi, l’Emilia Romagna 12 mila, il Piemonte 4 mila e la Lombardia 40 mila, nonostante abbia il doppio degli abitanti del Veneto: in tal modo questa Regione ha più che dimezzato le morti rispetto alle altre grandi regioni del nord Italia.
E’ importante effettuare, come il Veneto, molti tamponi a inizio epidemia per contenere e isolare poco alla volta la malattia: tale strategia permette di identificare precocemente i malati e i portatori sani, di isolarli, tracciarne i contatti, porre sotto sorveglianza i coabitanti dei malati, grazie alla sorveglianza e cura a domicilio ridurre i ricoveri in rianimazione, senza saturare gli ospedali, testare gli operatori sanitari e isolare i positivi, per impedire che ospedali e strutture sanitarie divengano fonte di contagio per la popolazione, come avvenuto in molti casi.
La raccolta dei dati e i sistemi informativi
I dati relativi al numero dei tamponi effettuati e delle persone sottoposte a tampone sono molto variabili, per più motivi.
- Tali numeri cambiano a seconda delle fasi della epidemia. Nella fase iniziale, il rapporto tamponi/persone tamponate è vicino a 1, perché vi sono moltissime persone sottoposte al test per effettuare la diagnosi, mentre i tamponi di verifica per accertare la guarigione sono molto pochi. Nelle fasi successive, il rapporto aumenta (più tamponi rispetto alle persone tamponate), perché il numero di nuovi contagiati si riduce e, invece, aumentano molto i tamponi di verifica della guarigione (che devono essere 2 per persona).
- I numeri variano enormemente tra i diversi Paesi, in quanto ai grossi database cui affluiscono i dati (come quelli dell’ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control), dell’OMS e della John Hopkins University vengono inviati, alternativamente, o il numero di tamponi effettuati, o il numero delle persone sottoposte al test. Raramente vengono forniti ambedue i dati.
In Italia, solo dal 19 aprile è stato aggiunto anche il numero di casi, ovvero le persone sottoposte al test. Per fare un esempio, la Lombardia alle ore 17 del 7 maggio aveva eseguito 455.000 tamponi, ma il numero totale delle persone sottoposte al test era di 263.000 (quindi quasi tutte le persone testate avevano eseguito due tamponi). Trattandosi di grandi numeri, un certo numero di tamponi va perso per smarrimento, perdita dell’etichetta, caduta dalle mani per errore umano, in quanto processati da personale sotto "stress lavorativo": sia a causa della stanchezza fisica di indossare ore ed ore i mezzi di protezione individuale, sia per l’eccesso di ore lavorate.
Un basso numero di tamponi agli inizi della fase 2 può portare a sottostimare i contagiati, incrementando una politica – economicamente necessaria, ma che non deve abbandonare le precauzioni per prevenire i contagi – di apertura delle attività con la guardia abbassata verso il rischio contagio.
Ripiombare nella situazione precedente sarebbe davvero grave; metterebbe a rischio anche quelle Regioni che, grazie al lockdown, sono riuscite a contenere sia rischi che perdite di vite umane. E potrebbe vanificare i sacrifici che abbiamo coraggiosamente affrontato e gestito, le donne soprattutto, per combattere la pandemia.
I test sierologici: cosa sono, i vantaggi e i limiti
I test sierologici sono esami eseguiti per ricercare la presenza di due tipi di anticorpi che l’organismo inizia a produrre contro le proteine dell’involucro di SARS-CoV-2: le immunoglobuline M (IgM) sono le prime a comparire in circolo dopo un “periodo finestra” muto di circa 4-14 giorni dal contatto con il virus e tendono a scomparire dopo qualche settimana, mentre le immunoglobuline G (IgG) sono prodotte più tardivamente (dopo 20-24 giorni dal contatto col virus e dopo circa 10 giorni dalle IgM) e permangono per periodi lunghi, come “memoria storica” dell’avvenuta infezione.
Esistono due tipi di test sierologici: i test rapidi e i test quantitativi.
I test rapidi si eseguono prelevando una goccia di sangue capillare, tramite digito-puntura sul polpastrello e ponendola su una piccola lastra di nitrocellulosa (contenente proteine virali coniugate con particelle colorate) che mette in evidenza la presenza di anticorpi su due barrette colorate, corrispondenti rispettivamente alle IgG ed alle IgM (metodica immuno-cromatografica). Invece i test quantitativi (più affidabili di quelli rapidi) sono effettuati su prelievo di sangue venoso e “misurano” la quantità di specifiche immunoglobuline presenti attraverso due diverse tecniche: la chemiluminescenza (CLIA) e il metodo ELISA.
I test sierologici non fanno diagnosi di malattia (solo i tamponi rilevano la presenza di RNA virale), ma indicano semplicemente se il paziente è entrato in contatto con il virus oppure no.
Se il test sierologico è negativo, significa che il soggetto in esame, privo di anticorpi, è suscettibile all’infezione.
Il test sierologico positivo indica, invece ,che il paziente è stato infettato dal virus, indipendentemente dalla manifestazione asintomatica, lieve o severa della malattia: in tal caso, il test va integrato con il tampone per rilevare se il virus è ancora presente o meno nell’organismo. Con test positivo e tampone positivo il paziente è ancora contagioso e si procede con l’isolamento obbligatorio (incluso l’isolamento fiduciario dei contatti stretti); con test positivo e tampone negativo il paziente può rientrare in comunità dopo 14 giorni (dopo riconferma dei risultati per escludere falsi positivi/negativi) e “potrebbe” ritenersi tendenzialmente protetto e immune.
In realtà, allo stato attuale delle conoscenze, non è affatto certo che lo sia: SARS-CoV-2 è un virus “nuovo” nel genere umano, le sue caratteristiche antigeniche in grado di essere riconosciute dal nostro sistema immunitario sono ancora instabili, non è noto “se tutte” le persone contagiate producano anticorpi, “quali” anticorpi, “in quale quantità”, “se” e “in che modo” gli anticorpi sviluppati saranno protettivi nei confronti di una futura reinfezione, “quante persone” dovrebbero risultare immuni per garantire la cosiddetta immunità di gregge, “per quanto tempo” l’immunità durerà e “quando” eventualmente svanirà e nemmeno “se” e “quanto” una vaccinazione di massa sarà necessaria.
Gli studi hanno mostrato che solo il 10-20% delle persone contagiate sintomatiche ha gli anticorpi e le stime fondate su dati di altre infezioni da Coronavirus hanno calcolato ipoteticamente una durata della memoria immunitaria per circa 1 anno. La verifica di questi dati sarà molto importante per diagnosticare lo stadio della malattia, per valutare l’adeguatezza della terapia col plasma dei soggetti guariti (in cui dovrebbero essere presenti anticorpi) e per stabilire la cadenza periodica dei richiami in un futuro calendario vaccinale.
Inoltre, gli attuali test sierologici rilevano la presenza di anticorpi IgM ed IgG (che riconoscono il Coronavirus, lo combattono e ne determinano una “certa” protezione da altri contagi, ma non bloccano il suo ingresso nella cellula), però non forniscono informazioni specifiche sugli “anticorpi neutralizzanti” che si legano specificamente alle proteine spikes “di aggancio” dei virus alla cellula, neutralizzandone la capacità infettante e rappresentando gli unici “veri” marcatori dell’immunità acquisita.
Alla luce di tutte queste considerazioni, è da ritenersi attualmente “errata e pericolosa” la convinzione che i test sierologici forniscano una “patente di immunità” per il futuro: indicano, solamente, che è avvenuta un’infezione da SARS-CoV-2.
Attualmente, molti laboratori offrono test sierologici a fine diagnostico individuale, a diversi costi ed affidabilità, ma tutti hanno un margine di incertezza ed occorrerebbe conoscerne la sensibilità e la specificità, per ridurre la possibilità di avere risultati falsi positivi (che possono verificarsi per una reattività crociata verso altri Coronavirus più diffusi, oppure nei pazienti trasfusi o con disordini autoimmuni) e falsi negativi (quando il test è eseguito nel periodo finestra in cui non si sono ancora prodotti anticorpi oppure nei pazienti immuno-compromessi).
Naturalmente, questi test non sono autodiagnostici, e non devono essere commercializzati ad utenti “non addetti ai lavori” per uso personale a domicilio.
Il Comitato Tecnico Scientifico (CTS) del Dipartimento di Protezione Civile del Ministero della Salute ha recentemente stabilito requisiti di sensibilità (che deve essere superiore al 90%), specificità (superiore al 95%), velocità di esecuzione (almeno 120 test all’ora) e di idoneità a essere applicati su larga scala, per validare un TEST UNICO su tutto il territorio nazionale: l’azienda statunitense Abbott si è aggiudicata il bando per la fornitura.
I test verranno inizialmente somministrati gratuitamente ad un campione di circa 150.000 persone, divisi per sei fasce di età, a scopi epidemiologici di monitoraggio della popolazione: per mappare la circolazione del virus, “fotografare” l’estensione della malattia, diagnosticare l’avvenuto contatto col virus (specie negli asintomatici), stimare il reale tasso di letalità, comprendere come avviene l’immunizzazione, fornire dati per definire scelte politiche e organizzare la graduale riapertura dalla Fase 2 in poi.
Non vi è però evidenza scientifica, né consenso unanime, circa l’utilità di estendere i test su larga scala a tutta la popolazione: finché non ci saranno chiare risposte scientifiche riguardo l’immunizzazione effettiva, risulta difficile basarsi sui test individuali per allentare le misure restrittive, determinare chi può tornare al lavoro “con sicurezza” e chi no, o per rassicurare chi risulta possedere gli anticorpi, incoraggiando comportamenti che potrebbero verificarsi pericolosi per la comunità.
Solamente nella categoria lavorativa del personale sanitario, a stretto contatto con alte cariche virali, si è ritenuto opportuno avviare screening con test sierologici.
Bibliografia e Sitografia
- Istituto Superiore di Sanità Raccomandazioni per il corretto prelievo, conservazione e analisi sul tampone oro/nasofaringeo per la diagnosi di COVID-19. Versione del 7 aprile 2020.
- Gruppo di Lavoro ISS Diagnostica e sorveglianza microbiologica COVID-19: aspetti di analisi molecolare e sierologica 2020, ii, 7 p. Rapporti ISS COVID-19 n. 11/2020 https://www.epicentro.iss.it/coronavirus/pdf/rapporto-covid-19-11-2020.pdf.
- OMS, https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance /laboratory-guidance.
- ECDC, European Centre for Disease Prevention and Control.
- Accademia Nazionale dei Lincei Commissione Salute SECONDO RAPPORTO COVID-19 Aprile 2020.
- Wyllie AL et al, Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID_19 patients than nasopharyngeal swabs. medRxiv 2020, doi.org/10.1101/2020.04.16.20067835.
